肿瘤相关成纤维细胞（CAF）在TME中的累积与结直肠的进展和复发密切相关，也与肿瘤免疫响应性密切相关。而趋化因子CXCL12（也被称作基质细胞养殖因子1，SDF1）宽阔由CAF分泌，与CXCR4或CXCR7辘集后不错招募特定的免疫细胞亚群而导致TME的免疫扼制情状，进而促进肿瘤进展。然则调控TME中CXCL12水平的身分有待辩论。
另一方面，生酮饮食（KD）在多项基础辩论中被证实对肿瘤助长有扼制作用，并被不雅察到对结肠癌、玄色素瘤、肾癌、非小细胞肺癌等的免疫查验点阻塞（ICB）诊治起到积极作用。然则生酮作用在免疫扼制微环境中的动态变化和具体机制仍然不明晰。
辩论限制1.KD减少免疫扼制细胞的积聚，增多TME中NK细胞、T细胞的数目
辩论者通过对免疫功能完备的C57肠癌小鼠和免疫功能裂缝的肠癌裸鼠喂养KD,发现KD导致的肿瘤扼制作用可能与TME中免疫情状相关（图1AB，补图1C）。随后对C57小鼠肿瘤组织进行流式分析，也发现KD喂养的小鼠TME中T细胞（尤其是CD8 T细胞）浸润更多（图1C-E），而巨噬细胞，尤其是M2型巨噬细胞减少（图1F、G）。
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图1
为了进一步细目KD指点的肿瘤浸润免疫亚群的变嫌表情，辩论者对肿瘤浸润CD45 白细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)并进行聚类分析，细目了11类细胞簇，并得到了与流式分析一样的限制，此外还不雅察到KD组的小鼠TME中NK细胞增多、CD4 Treg细胞减少（图1H-K）。
这些限制指示生酮作用扼制了TME免疫扼制情状的出现，增强了抗肿瘤免疫响应。
2.生酮作用的增多扼制了CAF中CXCL12的抒发
之前有报说念露出，CAF可能通过分泌CXCL12参与TME中免疫扼制情状的督察。为了研究生酮作用扼制免疫扼制情状是否与CAF相关，辩论者们构建了过抒发生酮酶HMGCS2的原代东说念主CAF（hCAF-05和hCAF6231），并对其进行了RNA测序，发现过抒发HMGCS2的CAF中CXCL12的mRNA抒发减少；且在不影响CAF生物记号物ACTA2、S100A4和MMP4的情况下，酮体β-羟丁酸（βHB）产生增多（图2A）,对细胞裂解液、细胞上清液进行RT-PCR、ELISA发现CXCL12卵白水平也出现着落（图2B、C）。而过抒发HMGCS2-C166A(酶活突变)的CAF中CXCL12mRNA的抒发、细胞裂解液中βHB抒发并无影响（图2A）。另一方面，给以CAFβHB照管后，其CXCL12mRNA和卵白抒发明显受到扼制（图2D、E）。而在给以KD饮食的小鼠原代CAF中相同不雅察到CXC12mRNA水平的裁减（图2F）。而βHB照管并不影响平素结肠成纤维细胞内CXCL12mRNA的水平。这指示了生酮作用对CAF内CXCL12抒发的特异性扼制。
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图2
3.KLF5介导CXCL12抒发的调控
在对过抒发HMGCS2的CAF进行RNA-seq的限制还指示了KLF5mRNA的裁减，RT-PCR相同证实了这少许（图3A、B）。在对东说念主的原代CAF和小鼠CAF进行βHB照管后，辩论者们发现KLF5在卵白水平也出现了着落（图3C）。因有报说念指示，βHB不错行为I类组卵白去乙酰化酶（HDACs）的内源性扼制剂，从组卵白H3赖氨酸9（H3K9ac）乙酰化的增多中不错看出，βHB扼制了CAFs中HDAC的活性，而使用I型HDACs的外源性扼制剂丁酸钠（NaBT）或HDAC1的遴选性扼制剂MS-275照管hCAF-05，或对hCAF-05进行HDAC1进行敲低照管后，细胞的KLF5(而非KLF4)抒发受到扼制（图3C）。这些限制指示生酮作用的增多通过扼制CAF的HDAC1来扼制其KLF5抒发。
接着，辩论者们运行研究KLF5是否调控CXCL12抒发。对hCAF-05进行过抒发KLF5腺病毒（Adv-KLF5）感染后，细胞CXCL12的mRNA和卵白抒发水平明显增多（图3D、E），而对过抒发KLF5的CAF进行βHB照管，CXCL12的mRNA抒发并未裁减（图3D）。另一方面，对CAF的KLF5进行敲降或外源性扼制后发现其CXCL12mRNA、卵白抒发裁减（图3F-H）。这些限制指示生酮作用通过扼制KLF5抒发来扼制CXCL12抒发。
KLF5不错通过与启动子原件辘集而促进靶基因的转录，其伏击的辘集序列为5’-GGGGTGGG-3’。辘集以往辩论，辩论者们揣度了KLF5与CXCL12启动子辘集的两个基序，并通过CAF进行了染色质免疫共千里淀（ChIp）对揣度位点进行了阐述，且发现KLF5基序1主要与CXCL12启动子区域进行辘集，而HMGCS2过抒发能使两者的辘集减轻（图3I、J）。对CXCL12启动子区域进行克隆后，将其与KLF5过抒发质粒进行共孵，发现CXCL12启动子活性明显增多，而如若KLF5辘集基序1被删除，其指点的CXCL12启动子活性增多的遵循也随之隐没（图3K、L）。这些限制指示KLF5通过辘集CXCL12启动子指点其转录。
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图3
4．增多生酮扼制CAF助长
将不同的CAF用βHB照管6天，发现CAF的增殖受到扼制,而过抒发HMGCS2也能扼制CAF的增殖（图4A-D）,具体浮现为G0/G1期断绝，以及p53、p21Waf1抒发的增多（图4E、F）。在体内辩论中，用WB检测CAFmarker α-SMA,发现KD喂养后荷瘤小鼠TME内CAF减少（图4G、H）。
而前述限制指示了生酮作用与KLF5调控CAF中CXCL12抒发的内在关联，因此接着辩论者们通过对CAF进行过抒发KLF5和βHB照管，发现酮体导致的CAF助长扼制被KLF5过抒发逆转，而KLF5敲低导致了CAF的增殖减少（图4I、J）。
以上两个限制证实，CAF的增殖受到HMGCS2/βHB/KLF5信号的调控。
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图4
5.结直肠癌患者的生酮处于下调情状
以上限制指示KLF5依赖的CXCL12抒发对TME的免疫扼制情状起到伏击作用，而生酮不错扼制这种情状的产生。接着辩论者们将眼神转到临床，发现βHB、HMGCS2在大部分结直肠癌患者组织内下调，而CXCL12高抒发（图5A-C）。对肠癌肝鼎新灶组织进行免疫组化分析，发现HMGCS2下结伴KLF5、CXCL12上调存在相关性（图5D）。
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图5
6.KD扼制肿瘤内CXCL12抒发，增强PD-1阻断诊治的疗效，扼制了肿瘤的助长和鼎新
基于以上限制，辩论者们摄取KD喂养结肠癌荷瘤小鼠，发现KD小鼠βHB抒发在血浆和肿瘤内皆明显高潮，CXCL12抒发明显减少（图6A-E）。因为有辩论指示CXCL12与结肠癌ICB耐药相关，因此辩论者们研究KD与ICB疗效之间的关系，发现KD喂养小鼠在PD-1阻断诊治中得回了更好的肿瘤扼制疗效（图6F-J）。
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图6
由于CXCL12CXCR4/CXCR7还被报说念与肿瘤的鼎新相关，辩论者进一步辩论了KD饮食与结肠癌鼎新间的关系。体外实验发现过抒发HMGCS2的CAF细胞的培养上清液不错扼制结肠癌细胞的移动（图7A-C）；小鼠实验发现KD饮食减少了小鼠结肠癌的肝、肺鼎新，且在KD喂养的荷瘤小鼠鼎新灶中βHB抒发升高，CXCL12抒发着落（图7D-G）。
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图7
以上限制指示KD扼制肿瘤内CXCL12抒发，增强PD-1阻断诊治的疗效，扼制了肿瘤的助长和鼎新。
辩论论断酮生成减少是结直肠癌的记号之一，而酮生成增多不错扼制CAF中KLF5依赖的CXCL12抒发，从而扼制TME中的免疫扼制情状，增强了PD-1阻断的诊治作用，扼制了结直肠癌的肝肺鼎新。指示了使用KD反抗CRC免疫违反和鼎新的潜在益处。
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推选情理1.本辩论将肿瘤辩论限度的热门——CAF、肿瘤代谢、免疫诊治辘集起来，系统地阐述了三者的关系，相关实验念念路和实验尺度值得模仿学习；
2.指示CXCL12信号可能是结直肠癌免疫诊治的疗效揣度因子，具有临床鼎新价值；
3.指示饮食结构或对肿瘤免疫诊治起到一定作用，对临床合手行有一定的带领真理。
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